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維生素E異構體分離

發表于:2021/4/29 14:59:27 來源:北侖機械

在4種維生素E異構體測試過程中,該如何進行鍵合相的選擇?是否遇到過β-生育酚和γ-生育酚分離不理想、峰形差、柱壓高等問題?面臨這些問題,我們該如何排查和解決?

一、鍵合相的選擇

首先我們看一下4種維生素E的結構(如圖1.1),對于反相分離模式,我們通常從極性差異來判斷能否分離,從非極性看,α-生育酚>β-生育酚≈γ-生育酚>δ-生育酚,用常規C18色譜柱,意料之中,β-生育酚和γ-生育酚由于非極性差異太小,不能實現分離(如圖1.2)。

圖1.1  維生素E結構式

圖1.2  C18分離4種維生素E異構體譜圖

同樣屬于反相分離模式,為什么C30色譜柱可以實現2種物質的分離呢(譜圖見后續二、三、四部分)?

首先我們看下C30色譜柱,和C18色譜柱相比,烷基鏈更長,由于填料的孔徑都是約為120?,孔表面鍵合的烷基鏈越長,不同位置鍵合的烷基鏈交叉重疊的可能性增大,待測組分通過孔內的阻力增大,C30分離β-生育酚和γ-生育酚依靠的是空間位阻作用。

二、“峰形差”怎么辦?

2.1 流速的影響

色譜條件:

色譜柱:Athena C30 4.6 × 250 mm, 3 μm(PN: LAEQ-462553)

柱溫:20℃

流速:0.8ml/min

進樣量:10μl

紫外檢測波長:維生素E為294nm

流動相:A:甲醇     B:水

測試結果:

按照GB5009.82-2016第一法中色譜條件,我們發現β-生育酚拖尾,為了排查β-生育酚拖尾原因,首先嘗試將流速調為0.9ml/min,β-生育酚不拖尾,在27.8min附近多一個鼓包,干擾α-生育酚的定量,不進樣走流動相,也有該鼓包,說明是流動相梯度混合產生的基線波動,流速為0.8ml/min時,基線鼓包和β-生育酚出峰接近,造成β-生育酚拖尾。繼續增大流速至1.0ml/min,目標物出峰時間提前,α-生育酚和基線鼓包可以分開。

按照GB5009.82-2016第一法中色譜條件,采用Athena C30 4.6 × 250 mm, 3 μm(PN: LAEQ-462553),通過增大流速,可以避免基線波動對目標峰的干擾,另外β/γ-生育酚的分離度也得到改善。具體結果見表2.1。

表2.1 不同流速條件的結果分析

2.2 流動相的影響

既然上述條件,β-生育酚“拖尾”是由于梯度程序造成,考慮到整個梯度程序流動相的組成差異很小,我們直接采用甲醇為流動相,也可以避免基線鼓包造成的峰形差等干擾。

總結:

該案例中的“峰形差”是梯度流動相梯度混合產生的基線波動造成的假象,通過增大流速或者將流動相調為甲醇即可解決。

三、β-生育酚和γ-生育酚分離不理想怎么辦?

3.1 流速的影響

參考表2.1,增大流速后可以避免基線波動對目標峰的干擾,另外β/γ-生育酚的分離度也得到改善。流速是怎么影響β-生育酚和γ-生育酚分離度的呢?還是要從分離度的計算公式來看,

增大流速后,由于色譜柱和流動相種類沒有變化,選擇性α保持不變,由于整個梯度程序,流動相的組成變化不大,所以k變化較小,而β-生育酚和γ-生育酚的柱效提高,所以分離度得到改善。

3.2 柱溫的影響

采用甲醇為流動相時,參考2.2中結果,β/γ-生育酚的分離度只有1.55,勉強達到基線分離,我們嘗試將柱溫降低為15℃,β-生育酚和γ-生育酚的分離度明顯得到改善,達到1.90。

柱溫是怎么影響分離度的呢?柱溫的影響相對比較復雜,它對柱效、選擇性和保留因子都有影響,從而對分離度產生影響,這里就不詳細分析柱溫對每個參數的影響程度了。這個案例說明β/γ-生育酚的分離對柱溫比較敏感,遇到分離度的問題時可以考慮降低柱溫。

總結:

β-生育酚和γ-生育酚分離不理想,梯度條件,可以通過增大流速解決,甲醇做流動相等度條件下,可以通過降低柱溫解決。

四、有沒有更好的選擇?

我們發現,用Athena C30 4.6 × 250 mm, 5 μm(PN: LAEQ-462552),粒徑從3 μm增大為5 μm,在滿足分離度的前提下,系統壓力更低哦,見表3.1。

表3.1 不同色譜條件下的對比

總結:

采用Athena C30 4.6 × 250 mm, 5 μm (PN: LAEQ-462552),甲醇做流動相,可以實現更優的結果,α-生育酚出峰時間早、β/γ-生育酚分離度好、柱壓更低。

五、總結

5.1 遇到“峰形差”問題,首先排查是否流動相的影響,可以通過空走流動相來確認,該案例中的“峰形差”是梯度流動相梯度混合產生的基線波動造成的假象,通過增大流速或者將流動相調為甲醇即可解決。

5.2 β-生育酚和γ-生育酚分離不理想,梯度條件,可以通過增大流速解決,甲醇做流動相等度條件下,可以通過降低柱溫解決。

5.3 采用Athena C30 4.6 × 250 mm, 5 μm (PN: LAEQ-462552),甲醇做流動相,可以實現更優的結果,α-生育酚出峰時間早、β/γ-生育酚分離度好、柱壓更低。

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